在进行高效液相色谱（HPLC）分析时，制剂样品中的辅料峰是一个关键但容易忽略的因素，它们的存在可能会对活性成分和杂质的检测造成影响。有时，实验中会出现所谓的“鬼峰”现象，这些未知的色谱峰很可能是由辅料引起的。因此，深入了解辅料的特性，对于准确解读色谱结果至关重要。
辅料峰的分类与影响
根据辅料的不同特性，我们可以将其出峰情况归纳为以下几类：
【不出峰】
大多数辅料由于几乎无紫外吸收，对色谱分析的影响可以忽略不计。这类辅料包括乳糖、预胶化淀粉、甘露醇、甲基纤维素、羟丙甲纤维素、羟丙纤维素、二氧化硅等。
【大极性辅料峰】
例如羧甲基纤维素钠和各种无机酸（如盐酸、氢溴酸），以及部分有机酸（如甲酸、乙酸、苹果酸等）。这类辅料峰通常不会对杂质和活性成分的检测造成干扰，大多在溶剂峰前或溶剂峰附近出峰，可以在分析方法中规定扣除特定保留时间前的辅料峰。
【中等极性辅料峰】
这类辅料由于在色谱柱中具有一定的保留，可能会干扰到杂质或活性成分的检测。例如三乙酸甘油酯、吐温、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）、部分有机酸（如丁二酸、己二酸、戊二酸、柠檬酸、富马酸等）。针对这些辅料，就需要选择恰当的液相方法，确保它们不会对目标物的检测造成干扰。特别需要注意的是，某些酯类辅料在强制降解试验或加速试验中可能会发生水解，导致原有峰的消失或在保留时间较后的位置出现新的峰。
实际案例分析
晶云星空服务的客户的某项目稳定性加速试验研究期间，随着时间的推移，我们注意到一个未知“杂质”的色谱峰面积出现了显著的降低。这一发现引起了我们的关注，因为它可能对药物的稳定性评估产生重要影响。通过对试验数据的仔细分析和对样品的深入研究后，我们得出了一个明确的结论：所观察到的“杂质”峰面积显著减小的现象，是由实验中使用的某品牌包衣粉内含的增塑剂三乙酸甘油酯所引起的。在加速试验的高温高湿环境下，三乙酸甘油酯水解成乙酸和甘油。这一化学变化直接导致了色谱图中相应峰面积的减少。
【小极性辅料峰】
对于小极性辅料，如硬脂富马酸钠等，在进行梯度洗脱色谱分析时，如果有机相的比例不足，可能会导致这些辅料无法在预定的色谱图记录时间内被洗脱，而是残留至下一针进样中。这种情况如果被忽视，可能会引起分析结果的误判，影响药物质量的准确评估，引发一系列的调查，甚至影响项目的研发进度。
美国药典中部分品种，采用每针进样后冲洗色谱柱的方式，来避免残留的辅料峰带来的干扰，如利托那韦片。
图片来源于美国药典
实际案例分析
而在晶云星空服务的客户项目中，也有遇到过类似的案例，如下图：在进样后的第三针色谱图中，出现了辅料峰：
经过仔细分析，我们确认该色谱峰归属于硬脂富马酸钠。鉴于客户在临床早期阶段对色谱条件有特定要求，以便于准确判定未知杂质归属，我们决定在不改变原有色谱条件的前提下，额外增加了一段更高的梯度，确保该辅料色谱峰在方法梯度条件下洗脱出来，避免残留带到下一针样品：
这一策略不仅满足了客户的需求，也提高了该分析方法的稳健性和可靠性。
在药物分析过程中，理解和掌握辅料的化学性质及其在色谱分析中的行为对于确保分析结果的准确性至关重要。为了有效地识别辅料峰并优化分离效果，我们就需要在方法开发和验证阶段进行适当的调整，如改变流动相的组成、调整梯度洗脱程序或使用不同类型的色谱柱。
同时，对于已知的辅料峰，应在分析方法中明确指出，并在数据处理阶段进行扣除，以确保药物中活性成分和杂质得到准确检测。这对于保障药物的安全性和有效性极为重要。此外，针对不同极性的辅料，应采取相应的色谱条件和分析策略，以进一步提高分析的准确性和可靠性。
【结语】
通过科学严谨的实验操作和数据分析，我们可以避免辅料干扰导致的分析误差，从而为药物研发和质量控制提供坚实的技术支持。晶云星空可为创新药客户提供从早期临床到商业化生产全生命周期的分析化学研究与质量控制服务。我们以QbD理念为核心，围绕口服固体制剂的CQA开展全面的分析方法开发以及符合ICH Q2的分析方法验证服务来支持并指导制剂的研发，对分析方法进行全生命周期管理，以确保质量研究与控制在药物研究的不同阶段提供准确可靠的数据。